CRISPR/Cas9作為一種新型的基因編輯技術，被廣泛應用于多種物種的基因組編輯研究。由于低效率的同源重組修復及無法預期的編輯類型，CRISPR/Cas9技術多用于基因敲除的研究。目前，如何在細胞內高效且特異地引入單核苷酸突變成為基因編輯的重大研究方向。

　　CRISPR/nCas9/dCas9技術融合胞嘧啶脫氨酶的堿基編輯系統(tǒng)自研發(fā)以來被廣泛關注，該系統(tǒng)不需要產生DSB和提供DNA模板就能有效地替代基因組中的特定堿基。堿基編輯器包含Cas9蛋白變體、胞嘧啶脫氨酶和尿嘧啶糖基化酶抑制劑（UGI）。

　　2019年5月22日，Plant Biotechnology Journal 雜志在線發(fā)表了華中農業(yè)大學棉花遺傳改良團隊題為"High Efficient and Precise Base Editing of C•G to T•A in the Allotetraploid Cotton（Gossypium hirsutum）Genome Using a Modified CRISPR/Cas9 System " 的研究論文，該論文利用Cas9缺口酶（nCas9），胞嘧啶脫氨酶（APOBEC1），尿嘧啶糖基化酶抑制劑（UGI）構建了適用于棉花遺傳轉化的堿基編輯系統(tǒng)（GhBE3）。實現(xiàn)了在棉花細胞內高效且特異地引入單核苷酸突變，具有很高的C•Gto T•A 的單堿基編輯效率，并且可以進行穩(wěn)定的遺傳轉化。

　　在此之前，華中農大棉花團隊已經發(fā)表了3篇關于棉花基因編輯的研究論文，系統(tǒng)的對棉花中不同方式的基因編輯進行了研究：2017年發(fā)表的"High efficient multi-sites genome editing in allotetraploid cotton（Gossypium hirsutum）using CRISPR/Cas9system”論文中，介紹了國際上*早的棉花編輯系統(tǒng)之一，該系統(tǒng)使用了棉花內源的U6啟動子和合適的抗生素篩選標記，使得CRISPR/Cas9技術在異源四倍體棉花中的應用具有高效特異的編輯；2018年發(fā)表了"Whole genome sequencing reveals rare off-target mutations and considerable inherent genetic or/and somaclonal variations in CRISPR/Cas9-edited cotton plants"，該論文利用高通量測序的方法，揭示了在CRISPR/Cas9編輯的棉花植株中，脫靶突變很少，更多地是受體材料固有遺傳或/和體細胞無性系變異；2019年發(fā)表了Robust CRISPR/Cpf1 （ Cas12a ） mediated genome editing in allotetraploid cotton（G.hirsutum）"的研究論文，該論文分析了Cpf1（Cas12a）蛋白在棉花異源四倍體中的編輯作用，具有很高的編輯效率，并且沒有發(fā)現(xiàn)脫靶效應。

　　在本研究中，作者利用Cas9缺口酶（nCas9），胞嘧啶脫氨酶（APOBEC1），尿嘧啶糖基化酶抑制劑（UGI）構建了適用于棉花遺傳轉化的堿基編輯系統(tǒng)（GhBE3）。選擇兩個內源基因（GhCLA，GhPEBP），設計了三個靶標（sgRNA1，sgRNA2靶向GhCLA基因，sgRNA3靶向GhPEBP基因），構建單堿基編輯載體并通過農桿菌介導進行棉花遺傳轉化。發(fā)現(xiàn)在棉花中靶標基因GhCLA，GhPEBP的三個靶標均被編輯，而且C-T的編輯效率達到57.78%，以靶標位點上多個C位點同時編輯為主；該系統(tǒng)在靶標序列上的“編輯窗口”為6個堿基（PAM序列遠端5'端3- 8的位置），且“編輯窗口”內C-T替換效率在總DNA序列中達到18.63％，靶標序列編輯窗口內的C-T編輯效率遠高于其余部位C-T替換的效率。

　　利用深測序檢測27個潛在脫靶位點，在潛在脫靶位點的編輯窗口內發(fā)生C-T替換比例均低于0.1%，統(tǒng)計分析后堿基編輯的植株和野生植株沒有脫靶效率的差異。此外，將兩個GhCLA基因編輯的單株和一個野生（Jin668）植株進行100×深度的全基因組測序以檢測脫靶效應。在從全基因組水平預測的1500個潛在脫靶位點上沒有發(fā)現(xiàn)脫靶突變，這表明單堿基編輯系統(tǒng)對棉花的基因組編輯具有較強的特異性。

　　該單堿基編輯系統(tǒng)系統(tǒng)在異源四倍體棉花中*應用，具有較高的C•Gto T•A 的單堿基編輯效率和特異性，它將成為棉花功能基因組研究新的重要的技術手段。

　　華中農業(yè)大學作物遺傳改良國家重點實驗室金雙俠教授為該論文的通訊作者，已畢業(yè)的碩士秦雷為*作者，張獻龍教授也參與了這項工作。該研究受到國家重點研發(fā)計劃（2016YFD0100203-9）和科技部轉基因植物研究與產業(yè)化專項（2016ZX08010001-006）和中央高?？蒲薪涃M（2013PY064，2662015PY028，2662015PY091 和0900206328）的支持。

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