CRISPR/Cas系統(tǒng)是目前發(fā)現(xiàn)存在于大多數(shù)細(xì)菌與所有的古菌中的一種免疫系統(tǒng)，被用來識(shí)別和摧毀抗噬菌體和其他病原體入侵的防御系統(tǒng)。然而，目前的9系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生脫靶效應(yīng)，導(dǎo)致一些不理想的結(jié)果。之后，一種新型的Cas蛋白（Cas12a/Cpf1）的出現(xiàn)擴(kuò)展了基因編輯所依賴的Cas蛋白的種類，這個(gè)新型蛋白與之前CRISPR／Cas9基因編輯系統(tǒng)相比，具有編輯過程簡(jiǎn)單，分子量小，更特異的PAM序列，剪切位置不同，產(chǎn)生粘性末端及脫靶效率低等優(yōu)點(diǎn)，因此，由它介導(dǎo)的CRISPR-cas12a系統(tǒng)作為一類新型的基因編輯工具，在植物的基因編輯中廣泛引起人們的關(guān)注。

　　2019年5月5日，Plant Biotechnology Journal 雜志在線發(fā)表了華中農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花遺傳改良團(tuán)隊(duì)題為“Robust CRISPR/Cpf1（Cas12a）mediated genome editing in allotetraploid cotton（G.hirsutum）”的研究論文，該論文分析了Cpf1（Cas12a）蛋白在棉花異源四倍體中的編輯作用，具有很高的編輯效率，并且沒有發(fā)現(xiàn)脫靶效應(yīng)。

　　值得注意的是這是華中農(nóng)大棉花團(tuán)隊(duì)發(fā)表的第三篇關(guān)于棉花基因編輯的研究論文，前兩篇論文分別是：2017年發(fā)表的“High efficient multi-sites genome editing in allotetraploid cotton(Gossypium hirsutum) using CRISPR/Cas9 system”以及2018年發(fā)表的“Whole genome sequencing reveals rare off-target mutations and considerable inherent genetic or/and somaclonal variations in CRISPR/Cas9-edited cotton plants”。

　　棉花是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，是天然纖維，植物蛋白的重要來源。目前種植*多的異源四倍體棉花因其龐大而復(fù)雜的基因組，大多數(shù)基因在At和Dt亞基因組多個(gè)同源拷貝，給棉花基因組功能研究帶來巨大挑戰(zhàn)。2017年，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花遺傳改良團(tuán)隊(duì)開發(fā)了在棉花異源四倍體中具有高效編輯效率的以CRISPR/Cas9載體，并且能夠穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化。為了在棉花中進(jìn)一步開發(fā)效率更高，特異性更強(qiáng)的基因編輯載體，該團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了以Cpf1（Cas12a）蛋白為工具的編輯載體，并在棉花中進(jìn)行了一系列的驗(yàn)證。

　　該研究以棉花內(nèi)源葉綠體形成相關(guān)基因（GhCLA）為靶標(biāo)，通過tRNA-sgRNA轉(zhuǎn)錄單元構(gòu)建了基因編輯載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化獲得了含LbCpf1質(zhì)粒載體的92株獨(dú)立的T0代再生植株。通過Sanger測(cè)序和高通量測(cè)序（Hi-Tom）檢測(cè)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植株的突變。Sanger測(cè)序結(jié)果顯示，92株T0獨(dú)立植株中有80株（有效率87%）在目標(biāo)位點(diǎn)檢測(cè)到突變，另一方面，Hi-TOM數(shù)據(jù)顯示，每個(gè)單獨(dú)的植物包含不同的編輯程度。表明LbCpf1在棉花植株中具有較強(qiáng)的編輯活性。在所有被編輯的植株中，突變程度在1~94.12%之間，其中在At和Dt亞基因組同時(shí)編輯的有編輯68個(gè)樣本，僅At或Dt亞基因組編輯6個(gè)樣本；作者根據(jù)sgRNAcas9_3.0.5軟件確定了*具潛力的六個(gè)脫靶位點(diǎn)，利用T1植物的位點(diǎn)特異性PCR產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測(cè)序，檢測(cè)這些潛在的脫靶位點(diǎn)后并未檢測(cè)到脫靶效應(yīng)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cpf1系統(tǒng)在棉花中更傾向于在目標(biāo)位點(diǎn)誘導(dǎo)DNA缺失，而不是堿基替換或插入。因此，在棉花基因組編輯中，CRISPR/Cpf1系統(tǒng)更傾向于產(chǎn)生大規(guī)模缺失，說明LbCpf1系統(tǒng)特異性強(qiáng)，是棉花基因組編輯的良好選擇。

　　華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室金雙俠教授為該論文的通訊作者，博士生李波和已畢業(yè)的碩士芮杭萍為共同*作者，張獻(xiàn)龍教授也參與了這項(xiàng)工作。該研究受到國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016YFD0100203-9）和國(guó)家科技部轉(zhuǎn)基因?qū)ｍ?xiàng)（2018ZX08010-05B）和中央高校科研經(jīng)費(fèi)（2013PY064,2662015PY028，2662015PY091和0900206328）的支持。

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